Detección rápida, sencilla y simultánea de diferentes tipos de virus y viroides de plantas mediante polisondas

Actualmente, el control de virus y viroides de especies vegetales es esencialmente preventivo, con el objetivo de reducir la incidencia de estas enfermedades y su difusión en el territorio. Tradicionalmente, los ensayos de infección viral se han basado en el bioensayo o la técnica serológica ELISA. Y en los últimos años se han puesto a punto técnicas de detección basadas en el componente molecular del patógeno (RT-PCR, PCR a tiempo real (TaqMan), etc) que han permitido incrementar significativamente el límite de detección, pero encareciendo el precio final del análisis. Por tal motivo, las tendencias en las técnicas de detección se han centrado en reducir costes/tiempo mediante la detección simultánea de varios patógenos.

Aún así, el coste derivado de estas metodologías es incompatible con prospecciones a gran escala, un aspecto de gran relevancia en cultivos con bastantes años de plantación. En este sentido, la tecnología basada en la Hibridación Molecular no radioactiva representa un método rápido, sencillo y fiable para la diagnosis rutinaria de los principales virus que afectan a diferentes cultivos.
Dentro de este campo, el grupo de Virología Molecular del Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (UPV-CSIC) lleva más de 20 años trabajando en métodos de detección viral alternativos a los tradicionales, lo que le ha permitido poner a punto la Hibridación Molecular para la detección rutinaria de los principales virus que afectan a los cultivos de clavel, gerbera, frutales de hueso, tomate y vid.

Lo novedoso de esta tecnología es que permite realizar el análisis simultáneo de múltiples patógenos mediante lo que se denomina Polisondas (se trata de una única sonda que contiene, fusionadas en tándem, las diferentes secuencias virales y/o viroidales).

Entre sus principales ventajas, las Polisondas permiten una detección simultánea de hasta 20 patógenos, en un tiempo reducido (1-2 días) y con una sensibilidad similar al test ELISA e idéntica para todos los patógenos analizados; además, destacan también por su bajo coste (con el equivalente al análisis de un solo virus por el test ELISA se puede analizar 15 virus y 4 viroides); y son fácilmente actualizables, lo que permite incorporar nuevos virus de interés en un plazo de 2-3 semanas.

En la actualidad, el grupo de Virología Molecular del IBMCP utiliza esta tecnología en la detección de virus y viroides en tomate, vid, frutales de hueso, clavel y gerbera.

El IBMCP ha aplicado esta tecnología para diferentes organismos y empresas del sector tales como: Barberet & Blanc, S.A. (clavel y gerbera, Murcia), Agromillora Iberia, S.L. (frutales de hueso, Barcelona), Centro de Semillas y Plantas de Vivero de Zaragoza (frutales de hueso) y diferentes laboratorios Nacionales de Referencia (Laboratorio de Sanidad Vegetal de Tenerife; Grupo de Virología e Inmunología del Instituto Agroforestal Mediterráneo de la Universitat Politècnica de València; Laboratorio de Sanidad Vegetal de Murcia; Laboratorio Agrario de Fraisoro, Gipuzkoa).

Relación de virus y viroides de los que tenemos sonda individual o polisondas para su detección:


1. Alfalfa mosaic virus, AMV
2. American plum line pattern virus, APLPV
3. Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV
4. Apple mosaic virus, ApMV
5. Apricot latent virus, ApLV
6. Arabis mosaic virus, ArMV
7. Australian grapevine viroid, AGVd
8. Avocado sunblotch viroid, ASBVd
9. Carnation etched ring virus, CERV
10. Carnation Italian ringspot virus, CIRSV
11. Carnation latent virus, CLV
12. Carnation mottle virus, CarMV
13. Carnation necrotic fleck virus, CNFV
14. Carnation vein mottle virus, CVMV
15. Carnation ringspot virus, CRSV
16. Carnation yellow fleck virus, CYFV
17. Citrus exocortis viroid, CEVd
18. Cucumber mosaic virus, CMV
19. Eggplant mottled dwarf virus, EMDV
20. Grapevine fanleaf virus, GFLV
21. Grapevine fleck virus, GFkV
22. Grapevine leafroll associated virus 1, GLRaV-1
23. Grapevine leafroll a

Aplicaciones

  • Detección de virus y viroides en tomate, vid, frutales de hueso, clavel y gerbera.
  • Adaptable a otros cultivos de interés.
  • Fácilmente modificable (2-3 semanas) para la detectar nuevos virus emergentes, como el virus del rizado del tomate Nueva Delhi, ToLCNDV.

Ventajas técnicas

  • Detección simultánea de hasta 20 patógenos, en un tiempo reducido (1-2 días)
  • Sensibilidad similar al test ELISA e idéntica para todos los patógenos analizados
  • Fácilmente actualizables, lo que permite incorporar nuevos virus de interés en un plazo de 2-3 semanas.

Beneficios que aporta

  • Bajo coste (con el equivalente al análisis de un solo virus por el test ELISA se puede analizar 15 virus y 4 viroides)
  • Se puede aplicar para la detección de un gran número de virus y viroides en las especies citadas: Tomate: 15 virus y 4 viroides (AMV, CMV, EMDV, PMoV, PepMV, PVY, TEV, ToCV, TICV, ToLCNDV, ToMV, TSWV, ToTV, TYLCSV, TYLCV, CEVd, PSTVd, TASVd, TPMVd); Vid: 13 virus y 5 viroides (ArMV, GFLV, GFkV, GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-6, GRSPaV, GRVFV, GVA, GVB, AGVd, CEVd, GYSVd-1, GYSVd-2, HSVd) Frutales de hueso: 8 virus y 2 viroides (APLPV, ACLSV, ApMV, ApLV, PBNSPaV, PPV, PDV, PNRSV, HSVd, PLMVd) Clavel: 7 virus (CERV, CIRSV, CLV, CarMV, CNFV, CRSV, CVMV) Gerbera: 6 virus (AMV, CMV, INSV, TMV, TRV, TSWV)

Experiencia relevante