Resumen
Los oligosacáridos de la leche humana (OLHs) y la parte glicana de los glicoconjugados son hidrolizados por las glicosil hidrolasas (GHs), las cuales son expresadas por la microbiota intestinal de niños lactantes promoviendo el establecimiento de una microbiota intestinal con beneficios para su salud. El objetivo de esta Tesis Doctoral consistió en la caracterización funcional de GHs de la microbiota intestinal de niños lactantes capaces de metabolizar OLHs y glicoconjugados, y el estudio de su relevancia biológica y su potencial biotecnológico.
Se aislaron cepas bacterianas a partir de heces de niños lactantes.Solo las cepas del género Bifidobacterium metabolizaron alguno de los OLHs testados. Bifidobacterium infantis Y538 consumió eficientemente todos los OLHs testados, mientras que las dos cepas de Bifidobacterium dentium Y510 y Y521 solo metabolizaron lacto-N-tetraosa (LNT) y lacto-N-neotetraosa (LNnT). Se caracterizaron dos ß-galactosidasas de B. dentium Y510; Bdg42A mostró la mayor actividad en LNT, hidrolizándolo en galactosa y lacto-N-triosa (LNTII), mientras que Bdg2A mostró actividad contra lactosa, 6'-galactopiranósil-N-acetilglucosamina, N-acetillactosamina y LNnT. También se aislaron cepas bacterianas con actividad glicosidasa extracelular de las heces de lactantes. B. infantis E17 y E18, y Enterococcus faecalis E8 y E41 exhibieron actividad de endo-ß-N-acetilglucosaminidasa, liberando N-glicanos de glicoproteínas. La endo-ß-N-acetilglucosaminidasa EndoE de E. faecalis E8 deglicosiló eficientemente la proteína S1 del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Tanto la EndoE silvestre como un mutante catalíticamente inactive mostraron actividad lectina frente a la proteína S1 y actividad neutralizante frente a la infección de un virus pseudotipado que presenta la proteína S de SARS-CoV-2 expresada.
También se identificaron GHs putativas a través del análisis metagenómico de las heces de niños lactantes, pertenecientes a los géneros Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola y Streptococcus. Se seleccionaron diez ¿-L-fucosidasas GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358 y Fuc5372). Las ¿-L-fucosidasas Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39 y Fuc1584 mostraron actividad hidrolítica frente a enlaces de fucosa ¿-1,3/4 y Fuc35A, Fuc193 y Fuc2358 mostraron actividad enlaces de fucosa ¿-1,2/3/4/6. Fuc30 mostró actividad sobre la enlaces de fucosa ¿-1,6 mientras que Fuc5372 mostró preferencia por los enlaces ¿-1,2. Fuc2358 mostró actividad frente a glicoconjugados con lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III y contra la mucina. Fuc18, Fuc19A y Fuc39 eliminaron fucosa de neoglicoproteínas y de la glicoproteína ¿-1 ácida.
Las ¿-L-fucosidasas aisladas fueron evaluadas por su capacidad para sintetizar fucosil-oligosacáridos (FUS) a través de reacciones de transfucosilación. Fuc2358 produjo rendimientos del 35% de 2'-fucosillactosa (2'FL) y también 3'-fucosillactosa (3'FL) y 1-fucosillactosa (1FL). Fuc5372 sintetizó 2'FL, 3'FL y 1FL, con una proporción más alta de 3'FL. Se llevó a cabo mutagénesis dirigida para aumentar los rendimientos de transfucosilación. Los mutantes Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R y Fuc5372-R230K mostraron una mayor relación entre la 2'FL producida y el pNP-Fuc hidrolizado que sus respectivas enzimas silvestres. Además, se observó que los residuos F184 de Fuc2358 y W151 de Fuc5378 afectan a la regioselectividad de la transfucosilación, la fenilalanina aumentando la selectividad por los enlaces ¿-1,2 y el triptófano aumentando la selectividad por los enlaces ¿-1,3.
Los resultados presentados muestran la diversidad de GHs presentes en la microbiota intestinal de niños lactantes y expanden el conocimiento sobre su especificidad, contribuyendo al conocimiento del posible papel de las GHs en la colonización bacteriana del tracto gastrointestinal y, además, muestra su potencial biotecnológico
Palabras clave
microbiota, metagenome, infant gut, glycoside hydrolases, human milk oligosaccharides, histo-blood group antigens, glycoproteins, transfucosylation, antiviral strategies, SARS-CoV-2, Bifidobacterium, alpha-L-fucosidases
