Resumen
La tesis doctoral se centra en el desarrollo de un hidrogel sensible a analitos, funcionalizado con sondas de ADN, con estructura difractiva como transductor óptico para aplicaciones de diagnóstico in vitro. El primer capítulo incluye una visión general de los diferentes conceptos relacionados con el biosensado, los desarrollos recientes en el mercado del diagnóstico in vitro y, en particular, los biosensores de ADN. Además, se presenta la síntesis y caracterización de hidrogeles, su papel como matriz de soporte en biosensado y las estrategias de inmovilización. Por último, se explican los conceptos básicos de la holografía como nueva estrategia de detección y el papel de las diferentes redes de difracción en la biosensación. A continuación, en el Capítulo 2, se discuten los objetivos de este proyecto. El objetivo de esta investigación es desarrollar hidrogeles que incorporen sondas de ADN y dotarlas de una estructura difractiva para que actúen como transductores ópticos sin etiquetas. Se consideran dos tipos de estructuras difractivas: redes holográficas de relieve superficial (SRG) y redes de transmisión de volumen (VTG). La fase inicial de este trabajo se centró en la optimización de hidrogeles, ajustando su composición para que actuaran como biosensores holográficos. Se seleccionaron acrilamida y bisacrilamida para la preparación del hidrogel mediante reacción de polimerización por radicales libres. Además, para introducir la respuesta del analito en la red de hidrogeles 3D, hubo que investigar y poner a punto diferentes estrategias de inmovilización de biorreceptores. En el capítulo 3, la estrategia optimizada consiste en incorporar directamente sondas de ADN modificadas con acridita mediante copolimerización con monómeros de acrilamida durante la formación del hidrogel. Los hidrogeles funcionalizados con ADN se caracterizaron mediante imágenes de fluorescencia y se exploró su versatilidad mediante la fabricación de microarrays. Por último, el hidrogel optimizado sensible a los analitos se utilizó como plataforma para la preparación de SRG. El capítulo 4 describe otro enfoque adoptado para la funcionalización del hidrogel con sondas de ADN. Se añadió un comonómero de acrilato de propargilo al hidrogel de acrilamida, con el fin de introducir la presencia de residuos alcínicos y facilitar una mayor incorporación de las sondas de ADN. Las sondas de ADN utilizadas tenían grupos terminales tiol y se incorporaron mediante química de clic tiol-eno/tiol-yo, debido a la presencia de enlaces C-C dobles y triples. Con esta estrategia, se demostraron dos enfoques de inmovilización de sondas de ADN: durante y después de la síntesis del hidrogel. Los resultados preliminares mostraron que los SRGs tienen potencial para detectar directamente la hibridación de oligonucleótidos en un formato libre de etiquetas. En el capítulo 5, se optimizó el proceso de grabación de VTGs no inclinados en capas de hidrogel para mejorar el rendimiento del transductor. Tras una cuidadosa evaluación de los parámetros de grabación holográfica, las composiciones de las soluciones de incubación y los tiempos de incubación, las estructuras VTG se grabaron con una buena reproducibilidad, logrando una excelente eficiencia de difracción. Además, se estudió su estabilidad en agua para bioensayos. Por último, se observó que los VTG, modificados con oligonucleótidos, respondían selectivamente hibridándose sólo con la diana complementaria, a la vez que conservaban sus propiedades de difracción. El trabajo de investigación demostró la viabilidad de utilizar redes difractivas en capas de hidrogel como biosensores libres de etiquetas, capaces de detectar sondas de ADN, complementarias a la secuencia inmovilizada, en un medio acuoso. Por último, en el capítulo 6, se analizan comparativamente el rendimiento y la aplicabilidad de los distintos enfoques estudiados y se discuten las perspectivas futuras de los hidrogeles de ácidos nucleicos para la detección holográfica.
Palabras clave
hydrogels, diffractive gratings, label-free, biosensor
