Resumen
Plant Molecular Farming (PMF) es la producción de proteínas de interés industrial y valor comercial en plantas. Su objetivo es proporcionar un enfoque seguro y rentable para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. Las plantas del género Nicotiana, especialmente Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana, han adquirido una importancia creciente como plataformas de producción de PMF debido a sus ventajas, como el alto rendimiento de biomasa, la facilidad de transformación y la expresión robusta de proteínas. Sin embargo, en la actualidad N. tabacum y N. benthamiana no son hospedadores ideales para el cultivo molecular. Los objetivos de mejora genética, como retrasar o suprimir la floración para aumentar la biomasa de la planta, podrían convertir a N. benthamiana en un chasis de primera para fines de cultivo molecular. En este trabajo de investigación nos centramos en este objetivo. En el primer capítulo, realizamos un análisis de todo el genoma de los genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicados en la transición de fase vegetativa y el tiempo de floración, en esta especie y en su pariente cercana N. tabacum, identificando 49 genes SPL en N. tabacum y 43 genes SPL en N. benthamiana. Los genes SPL de las dos especies se clasificaron en ocho grupos filogenéticos de acuerdo con la clasificación de SPL en Arabidopsis thaliana. La estructura génica exón-intrón y los dominios de unión al ADN se conservaron en gran medida entre homeólogos y ortólogos, y también se identificaron las dianas potenciales del microARN156, implicado en la transición de fase vegetativa. La expresión de genes SPL en hojas se analizó mediante RNA-seq en tres fases de crecimiento diferentes, revelando que los genes que no estaban bajo el control de miR156 se expresaban en general de forma constitutiva a niveles altos, mientras que los genes regulados por miR156 mostraban niveles de expresión más bajos, a menudo regulados por el desarrollo. Seleccionamos el gen SPL13_1a de N. benthamiana como diana para un experimento de knockout CRISPR/Cas9. El knock out completo de este único gen condujo a un retraso significativo en el tiempo de floración de 2-5 días y a un aumento de la ramificación. En el segundo capítulo, mostramos más ediciones de genes CRISPR/Cas9 realizadas en N. benthamiana con el objetivo de la abolición de la floración. Se eliminaron los inductores florales FLOWERING LOCUS T 4 y 5 (NbFT4 y NbFT5_1a/1b) solos y en combinación con NbSPL13_1a. En la línea más editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el tiempo de floración se duplicó en comparación con las plantas de tipo silvestre. Sin embargo, no se logró la abolición total de la floración. El retraso de la floración tuvo consecuencias en varios aspectos del crecimiento de la planta, que cuantificamos a través de diversos parámetros: las líneas altamente editadas presentaron un aumento de la biomasa, la altura, el número de hojas y el área foliar total en comparación con las menos editadas y el tipo silvestre. Además, se evaluó el potencial de las líneas generadas para expresar proteínas heterólogas. Inesperadamente, no fueron capaces de mantener altos niveles de expresión después de la quinta semana. En el futuro, se apilarán en nuestras líneas knockouts en otros actores importantes en el inicio de la floración, como NbSPL9/15 y NbSPL3/4/5.
