Resumen
La iniciación de la traducción eucariota es un proceso altamente regulado donde se produce el acomodamiento del Met-tRNAiMet en el sitio P del ribosoma emparejado con el codón de inicio AUG del mRNA. Durante este proceso, participan un conjunto de factores de iniciación de la traducción o eIFs entre los cuales eIF1, eIF5, eIF3, y eIF2 como complejo ternario (TC) unido a GTP y al Met-tRNAiMet, pueden interaccionar entre ellos previamente a su unión con la subunidad ribosómica 40S formando un gran complejo llamado complejo multifactorial (MFC), que favorece el posterior ensamblaje del complejo de preiniciación (PIC) y el reconocimiento del codón de inicio. Aunque la formación del MFC no es esencial para que ocurra el proceso de iniciación, la unión de los distintos eIFs al PIC es cooperativa cuando lo hacen de este modo mejorando la eficiencia del proceso. A pesar de que las estructuras (o partes de ellas) de algunos de los eIFs que forman parte del MFC ya se han resuelto, la estructura del complejo sigue siendo desconocida. En este trabajo, se han empleado técnicas estructurales como la microscopía electrónica de tinción negativa y la criomicroscopía electrónica, mediante las cuales se han obtenido evidencias de que determinados dominios de algunos eIFs que constituyen el MFC adquieren una forma mucho más compacta a través de su interacción con el resto de los componentes del complejo, a diferencia del comportamiento más móvil y/o flexible que presentan una vez se asocian al PIC. Además, mediante técnicas biofísicas como la espectrometría de masas en condiciones nativas y la fotometría de masas, se resalta el importante papel que desempeña el factor eIF5 a través de su dominio C-terminal (CTD) en la formación del MFC, sugiriendo que son necesarias dos moléculas de este para su correcto ensamblaje.
Además de la complejidad inherente al proceso de iniciación de la traducción, es importante señalar que algunas proteínas, aunque no sean estrictamente esenciales en la iniciación, pueden ejercer funciones reguladoras. Un caso representativo es la proteína humana BZW2, que desempeña un papel muy importante en la selección del codón de inicio al promover la selección de codones AUG e incrementar la fidelidad del proceso. BZW2, también conocida como eIF5-mimic-protein, es capaz de antagonizar a eIF5 durante el proceso de selección del codón de inicio gracias a la presencia de un dominio HEAT en su región CTD con el que compite con eIF5 por la unión a eIF2. Este dominio comparte homología estructural con el dominio HEAT de eIF5_CTD implicado en las interacciones con los eIFs 1, 1A, 2 y 3, y con el que regula la fidelidad del proceso. En la presente Tesis, se han llevado a cabo estudios interactómicos mediante técnicas como "pull-down" o termoforesis en microescala entre BZW2 y todas las dianas de interacción conocidas de eIF5, que demuestran la capacidad de BZW2 de interaccionar con todas ellas pudiendo antagonizar el resto de las funciones que desempeña eIF5 en la iniciación.
Finalmente, en la etapa de final de esta Tesis, se han dado los primeros pasos para establecer la estrategia de ensamblaje de complejos de preiniciación funcionales. Se ha logrado obtener estructuras a alta resolución de un 43S PIC, y un 48S PIC con un codón de inicio distinto al AUG mediante criomicroscopía electrónica, que nos pueden ayudar a entender el proceso de discriminación de la primera base del codón y cómo afecta ésta al ensamblaje del complejo.
