Resumen
Los hongos patógenos son un riesgo para la salud y la seguridad alimentaria, debido a las infecciones fúngicas y las cepas multirresistentes. Las proteínas antifúngicas (AFPs) son proteínas catiónicas, ricas en cisteína y secretadas por hongos filamentosos que emergen como una alternativa para el desarrollo de nuevos antifúngicos, debido a sus propiedades fisicoquímicas, actividad de amplio espectro y no toxicidad. El patógeno de poscosecha Penicillium expansum codifica tres AFPs, siendo PeAfpA la que presenta mayor actividad. En esta tesis profundizamos en el modo de acción de PeAfpA frente a Saccharomyces cerevisiae y el principal patógeno de poscosecha de cítricos, Penicillium digitatum. Además, caracterizamos estructuralmente PeAfpB y exploramos la viabilidad de la ingeniería de proteínas con AFPs para identificar determinantes antifúngicos y modular sus propiedades.
Combinamos un análisis transcriptómico con un cribado de mutantes de deleción de S. cerevisiae y estudios de biología celular para estudiar el mecanismo de acción de PeAfpA frente a levaduras. La pared celular resultó ser importante para la actividad anti-levadura de PeAfpA, la cual es capaz de penetrar en la levadura mediante mecanismos dependientes e independientes de energía. Además, la defensa de la levadura parece depender del metabolismo del fosfatidilinositol y del gen ROX3.
Utilizamos P. digitatum para investigar el modo de acción de PeAfpA contra hongos filamentosos y descubrimos que se diferencia de otras AFPs en que no promueve la producción de especies reactivas de oxígeno. Los estudios de microscopía revelaron una dinámica compleja de unión e internalización de PeAfpA, mostrando un patrón de unión punteado en conidios quiescentes que cambiaba durante la germinación a una distribución uniforme y más intensa. La melanina resultó ser un factor importante en este proceso. PeAfpA solo se internalizó en hifas, adhiriéndose y penetrando preferentemente a través del ápice. La internalización se produjo mediante un proceso no endocítico pero dependiente de energía y se observó que la manosilación de proteínas determina la actividad de las AFPs en P. digitatum.
Para descubrir determinantes antifúngicos de las AFPs, resolvimos la estructura de PeAfpB, que permitió el diseño racional y la producción biotecnológica de proteínas quiméricas PeAfpA::PeAfpB. Las quimeras chPeAFPV1 y chPeAFPV6 se diferenciaban de PeAfpB en uno y dos aminoácidos, respectivamente, que afectaban al motivo conservado gamma-core. Estas quimeras fueron las más potentes, confirmando la relevancia del motivo gamma-core para su actividad. Por otro lado, chPeAFPV3 y chPeAFPV7 eran prácticamente inactivas, lo que evidencia el papel crucial del bucle L3 para su actividad. También demostramos que la unión a lípidos está parcialmente correlacionada con la actividad antifúngica. La mayoría de las proteínas activas mostraron afinidad por fosfolípidos, a diferencia de las inactivas, lo que subraya el papel de L3 en la capacidad de unión a lípidos. La permeabilización de membrana se detectó tras la internalización y se correlacionó con la actividad antifúngica. Estudios posteriores deberán confirmar si la permeabilización forma parte del mecanismo de acción o si es consecuencia de la muerte celular. El comportamiento diferencial de las quimeras se atribuyó a cambios en aminoácidos específicos y no a una reorganización de su estructura general. Por último, demostramos que PeAfpA, PeAfpB y las quimeras no son tóxicas frente a Galleria mellonella. Además, PeAfpA pudo unirse a la pared celular de Candida auris, penetrar y matar al patógeno, evidenciando su potencial biomédico.
En resumen, esta tesis amplía el conocimiento sobre el modo de acción de las AFPs, posiciona a PeAfpA como una candidata prometedora para diversas aplicaciones y valida el potencial de las AFPs para el diseño racional y producción recombinante de nuevas proteínas antifúngicas con atributos modificados.
Palabras clave
Antifungal proteins (AFPs); cell wall; chimeras; confocal microscopy; crystallography; filamentous fungi; lipid binding; mannoproteins; melanin biosynthesis; membrane permeabilisation; phospholipids; protein internalisation; rational design; reactive oxygen species (ROS); transcriptomics; yeast deletion collection; 3D structure.
