Resumen
La detección y diagnóstico de resistencias en Mycobacterium tuberculosis (MTB) supone un reto para el control de la tuberculosis (TB). La técnica diagnóstica implica el cultivo de muestras diagnósticas, pero este proceso es lento y retrasa los resultados hasta meses demorando la prescripción del tratamiento óptimo. El cultivo también se utiliza para enriquecer muestras diagnósticas con fines de investigación, como la secuenciación del genoma de MTB. Sin embargo, se desconoce si cultivar reduce la diversidad genética de la muestra diagnóstica, sesgando los resultados. Actualmente, las técnicas moleculares permiten evitar el cultivo en el diagnóstico, detectando resistencia a antibióticos más rápidamente, pero se limitan a identificar las mutaciones comunes asociadas a la resistencia a la rifampicina (RIF) e isoniazida (INH), los fármacos de primera línea. No obstante, la composición compleja de las muestras diagnósticas como el esputo sigue siendo un desafío para la secuenciación. Esta tesis presenta técnicas y estrategias de secuenciación para recuperar MTB a partir de esputos, centrándose en la diversidad genética en esputos y cultivos y explorando el potencial de la secuenciación para determinar resistencias.
En el Capítulo 1 comparamos la diversidad genética entre pares de esputos y cultivos en dos entornos diferentes. Desarrollamos una técnica de secuenciación de esputos, realizando una secuenciación directa o enriquecida según la cantidad de MTB presente. Además, implementamos un flujo de análisis para descartar artefactos del procesamiento de muestras. Los resultados muestran una alta concordancia en la diversidad entre esputos y cultivos, cuestionando la hipótesis inicial del cuello de botella en el cultivo.
En el Capítulo 2 exploramos las limitaciones del Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) para identificar mutaciones de resistencia a RIF, examinando las mutaciones de resistencia más prevalentes en el sur de Mozambique. Utilizamos la secuenciación del genoma completo para identificar variantes de resistencia en cepas recolectadas en Manhiça, Mozambique. Detectamos dos cepas con mutaciones de resistencia a RIF no identificadas por el XpertUltra y una alta prevalencia de cepas resistentes a INH sin resistencia a RIF (no multirresistentes, MDR). Los resultados sugieren que el XpertUltra podría no detectar algunos casos de resistencia a RIF y/o INH, destacando la necesidad de incluir nuevas mutaciones en las pruebas moleculares.
En el Capítulo 3 evaluamos el potencial de la secuenciación de amplicones para predecir la resistencia a antibióticos e identificar el linaje de las cepas. Diseñamos un panel de nueve genes asociados a la resistencia a siete antibióticos y dos regiones filogenéticas, poniendo a punto una PCR multiplex para amplificar todas las regiones en una sola reacción. A diferencia de otros paneles, los cebadores diseñados cubren los genes completos para detectar todas las mutaciones presentes. La secuenciación se realiza con MinION (Nanopore), una plataforma portátil con análisis en tiempo real. Comparamos las variantes obtenidas con las de Illumina para calibrar los parámetros del llamado de variantes y evitar falsos positivos. Los resultados muestran una alta correlación entre MinION e Illumina en la detección de resistencia e identificación de linajes, independientemente del tipo de muestra. Estos resultados, junto con el análisis en tiempo real de MinION, son prometedores para su implementación en atención primaria.
En conclusión, esta tesis contribuye a los avances en la genómica de muestras diagnósticas. Por un lado, demostrando que el cultivo refleja la diversidad genética del esputo, y por otro, revelando el potencial de la secuenciación del genoma y de amplicones para predecir resistencia a antibióticos. Las técnicas y resultados que se presentan contribuirán a promover la secuenciación directa de esputo como técnica de diagnóstico rápida y precisa, pero también su uso para la investigación.
