K9012-2006 - Detección simultánea de distintos aislados de Pepino mosaic virus (PepMV) mediante RT-PCR // A Multiplex RT- PCR Assay to characterize Pepino mosaic virus (PepMV) isolates

El método permite la detección simultánea y caracterización de cinco aislados diferentes del Pepino mosaic virus (PepMV). Los aislados que diferencia este método son Europeo, Peruano, Chileno 1 /US1, Chileno 2 y US2. El método incluye un primer análisis mediante multiplex RT-PCR en un paso, con una mezcla de tres parejas de cebadores específicos que amplifican una zona del gen de la RNA polimerasa RNA dependiente del virus. Con esta multiplex RT-PCR se consigue separar entre tres grupos de aislados diferentes: Europeo/ Peruano, Chileno 1/ US1 y Chileno 2/ US2. Con el producto de PCR obtenido, dependiendo del grupo de aislado obtenido, se realiza un análisis de restricción con dos enzimas diferentes en función del caso: SacI y HpaI. En el caso de obtener una amplificación en la Multiplex RT-PCR del grupo de aislados Europeo/ Peruano se emplea el enzima SacI en la digestión, que permite la separación entre ambos aislados. Si la amplificación obtenida en el primer análisis corresponde al grupo Chileno 2/US2 el enzima a emplear en la restricción será HpaI, que diferencia estos dos aislados. En España han aparecido nuevos aislados de PepMV que coexisten con los presentes infectando al cultivo del tomate, produciendo en ocasiones sintomatologías atípicas y más agresivas que las observadas hasta el momento. Además en ocasiones estos nuevos aislados han escapado a los métodos de detección habitualmente empleados. Este método permite la rápida detección y diferenciación de diferentes aislados de PepMV. // The method allows the simultaneous detection and identification of five different isolates of PepMV: European, Peruvian, Chilean 1- US1, Chilean 2 and US2. The method includes a one-step multiplex RT-PCR reaction for the simultaneous detection of three different groups of PepMV isolates: European- Peruvian, Chilean1- US1 and Chilean 2- US2. This multiplex RT-PCR is performed with a mix of three pair of specific primers that amplify a part of the RNA dependent RNA polymerase gene. An internal control is included to ensure the correct amplification. To separate the isolates from each group, the PCR fragment obtained is directly digested with two different digestion enzymes: SacI or HpaI. When the amplification product of the Multiplex RT-PCR corresponds to European- Peruvian group, SacI is chosen as the digestion enzyme. The restriction analysis of the PCR fragment that belongs to the Chilean 2- US2 is achieved with the enzyme HpaI. New PepMV isolates and recombinant isolates with the existing isolates have emerged in Spanish fields showing atypical and more aggressive symptomatology than the known ones. Sometimes, these isolates elude the detection methods that are usually used. Therefore this method allows the rapid detection and differentiation of the new isolates of PepMV presently known.